La
diagnosi di malattie genetiche
Tecniche di genetica classica
Ma….qual è l’obbiettivo della
terapia genica?
Una volta per la diagnosi delle malattie ereditarie ci si basava solo ed esclusivamente sulla storiologia della famiglia, non potendo così garantire una diagnosi precisa e soprattutto non potendo garantire a coppie con parenti affetti da una malattia ereditaria la possibilità di mettere al mondo figli malati. Grazie al Progetto Genoma è stato possibile identificare i geni responsabili di malattie. Per prima cosa bisogna identificare la natura delle alterazioni genetiche nel DNA: ve ne sono di diverso tipo, che causano in ogni caso un cambiamento nelle proprietà funzionali del loro prodotto genetico. Questi cambiamenti hanno conseguenze diverse: la proteina può essere prodotta in quantità eccessive, insufficienti o addirittura può non essere prodotta e in altri casi viene alterata la funzionalità del prodotto genetico. Le alterazioni a livello di DNA possono essere divise in due gruppi principali: anomalie cromosomiche cariotipicamente evidenziabili e anomalie non identificabili con il solo studio microscopico dei cromosomi. Le prime sono state oggetto di innumerevoli studi e possono quindi essere identificate rapidamente anche con la più moderna tecnica nota come painting cromosomico. Il secondo gruppo di malattie ha trovato invece spazio per l’analisi nel Progetto Genoma. Queste alterazioni devono essere studiate con metodiche di ingegneria genetica e possono essere raggruppate in tre categorie:
·
delezioni,
inserzioni, inversioni, duplicazioni non visibili al microscopio ottico;
·
mutazioni
puntiformi: nonsenso, missenso, mutazioni ai siti di splicing, nelle regioni
regolatrici;
·
mutazioni
dinamiche (da aumento di triplette ripetute).
Le alterazioni della prima categoria avvengono su scala
ridotta e non possono così essere documentate con un’analisi del cariotipo.
Quelle più facilmente evidenziabili sono la delezione, l’acquisizione o il
raddoppio di nucleotidi di una sequenza genetica. Per la loro identificazione
vengono utilizzate tecniche basate su particolari tipi di elettroforesi. La perdita, l’acquisto o
la duplicazione di nucleotidi porta ad avere un RNA messaggero cui mancano o
sono aggiunte una o più basi, anche se è possibile che avvenga una brusca
interruzione nella traduzione del codice e quindi si abbia una proteina
troncata che non è in grado di svolgere la propria funzione.
Nella seconda categoria avvengono
mutazioni puntiformi che riguardano le singole basi e che producono diversi
difetti. Ci potranno essere mutazioni missenso[LT1], nonsenso[LT2], silenti o sinonime[LT3].
Infine consideriamo la scoperta più recente, ovvero le
mutazioni dinamiche. Alcune patologie sono dovute alla presenza di una fila di
triplette nucleotidiche che subiscono un allungamento anomalo.
Per ricercare queste diverse alterazioni, vengono
impiegate diverse tecniche.
Tecniche di genetica classica
L’analisi citogenetica rappresenta un importante
strumento di diagnosi di molte malattie. Essa consiste nell’analisi al
microscopio ottico del cariotipo (cromosomi che rappresentano il nostro
patrimonio genetico). Questa tecnica permette di identificare le alterazioni
del DNA di una certa entità. Una modificazione a questa analisi del cariotipo è
la FISH (fluorescente in situ hybridization) in cui alcuni tratti del DNA
vengono marcati con differenti fluorocromi e poi fatti appaiare a cromosomi
ottenuti dalle cellule arrestate in metafase. La FISH è stata utilizzata
specialmente nella fecondazione assistita in coppie a rischio per malattie
legate al cromosoma X.
Diagnosi prenatale
La diagnosi prenatale di molte malattie genetiche si
basa su campioni di cellule fetali o di sostanze chimiche prodotte dal feto.
Attualmente vengono utilizzate due tecniche: l’amniocentesi e il prelievo dei
villi coriali. Dopo la raccolta dei campioni vengono eseguiti dei test che
permettono la diagnosi.
L’amniocentesi - è un procedimento particolare attraversi il quale
viene prelevato il liquido amniotico che si accumula tra il feto e la membrana
amniotica quando un feto ha quattro o più settimane di vita. Dopo aver
determinato la posizione del feto si inserisce un ago sterilizzato nella parete
addominale della donna incinta fino a raggiungere l’amnio (membrana
impermeabile che circonda l’ambiente acquoso in cui si sviluppa il feto) e il
liquido amniotico. Vengono successivamente prelevati 10-20 ml di liquido sul
quale viene eseguita l’analisi.
Prelievo dei villi coriali – il corion è la membrana esterna
dell’uovo fecondato; è costituito da uno strato superficiale e da uno strato
profondo. Nei mammiferi dotati di placenta, sulla superficie esterna del corion
si formano delle propaggini riccamente vascolarizzate dei vasi ombelicali.
Questi sono i villi coriali che concorrono alla costituzione della parte fetale
della placenta. Per prelevare i villi coriali si inserisce nell’utero un
piccolo tubo attraverso la vagina e si aspirano alcuni villi per l’analisi. Il
prelievo dei villi coriali può essere eseguito all’ottava settimana di
gravidanza.
Diagnosi pre-impianto
E’ possibile avere una diagnosi genetica prima che gli embrioni vengano impiantati nell’utero materno grazie alle tecniche di fertilizzazione in vitro. Questa diagnosi permette di selezionare solo gli embrioni identificati come non affetti da malattia.
Le tecniche impiegate sono le stesse della diagnosi
prenatale.
Ma….qual è l’obbiettivo della terapia genica?
L’obiettivo è di inserire all’interno di cellule
umane un gene che svolga una funzione terapeutica. Quindi per una malattia
ereditaria dovuta a un gene difettoso si dovrebbe inserire una copia clonata
sana del gene. Per trasportare il gene sano all’interno delle cellule ci si
serve di vettori virali[LT4].
I virus più utilizzati sono i seguenti:
·
adenovirus- hanno una durata limitata in quanto non si integrano nel genoma.
Possono essere iniettati in vivo
·
retrovirus- restano nel DNA della cellula per sempre, passando quindi alla
progenie. Non possono essere iniettati in vivo quindi le cellule interessate
devono essere tolte dall’individuo malato, essere messe a contatto col virus e
poi reiniettate
·
virus adenoassociati- presentano proprietà miste tra il retrovirus e
l’adenovirus